Svårare att upptäcka än EPO, gendopning är en mindre rapporterad front i kampen för ren cykling
Doping- och antidopinghistorien är ungefär som Wile E. Coyote jagar Road Runner: oavsett hur nära Wile E. kommer Road Runner, är den senare alltid steget före. Detta verkar i ännu högre grad vara fallet för ett nytt, skumt hörn av dopning som kan låta som ett science fiction-manus, men som faktiskt har funnits i minst två decennier: gen (eller genetisk) doping.
Men trots den snabba utvecklingen av gendopning kan en ny testmetod för gendopning utgöra en viktig vändpunkt mot användningen av gener i prestationsförbättringssyfte.
ADOPE (Advanced Detection of Performance Enhancement) presenterades vid University of Stirling, Skottland, i början av september och är ett av mycket få kända tester mot gendopning.
Metoden har utvecklats av en grupp forskare från Technical University of Delft, Nederländerna, och den kommer att tävla mot mer än 300 andra lag vid 2018 års tävling för genetiskt framställda maskiner; prisutdelningen kommer att hållas i Boston, MA, den 28 oktober.
Först till kvarn: vad är gendopning?
Gendopning är "missbruk" av genterapi i syfte att förbättra prestationsförmågan. Genterapi, å andra sidan, är en teknik som använder gener snarare än droger eller operationer för att behandla eller förebygga sjukdomar.
Terapien består i leverans av externt genetiskt material till en patients celler. Det genetiska materialet – som innehåller ett specifikt uttryck som aktiverar de proteiner som används för att behandla sjukdomen – sätts in i cellerna med hjälp av en extern vektor (norm alt ett virus).
Låt oss ta EPO, till exempel. Erytropoietinet – proteinet som stimulerar produktionen av röda blodkroppar i benmärgen och följaktligen ökar nivåerna av hemoglobin i kroppen och syretillförseln till vävnaderna – utsöndras norm alt av njurarna.
EPO-injektioner har varit den ökända prestationsförbättringen som cyklister missbrukade i flera år, särskilt på 90-talet.
I dag, även om fall av EPO-positivitet fortfarande rapporteras, har det blivit svårare att komma undan med denna praxis eftersom antidopningskontroller kan upptäcka extern EPO ganska effektivt nuförtiden.
Gendopnings alternativet, som förbättrar EPO-produktionen genom införande av nytt genetiskt material i en idrottare, skulle dock så småningom se ut som en naturlig produkt av idrottarens egen fysiologi och inte som en förbjuden substans.
Även om genterapi fortfarande endast används för sällsynta sjukdomar som inte har något botemedel (som svår kombinerad immunbrist, blindhet, cancer och neurodegenerativa sjukdomar) har forskare erkänt att människor från idrottsvärlden har kontaktat dem och bett dem att använda dessa terapier som ett sätt att förbättra sina sportprestationer.
WADA och gendopning
World Anti Doping Agency (WADA) anordnade den första workshopen för att diskutera gendopning och dess hot 2002, medan metoden var listad på WADA:s lista över illegala substanser och metoder året efter.
Sedan dess har WADA ägnat en del av sina resurser för att möjliggöra upptäckt av gendopning (inklusive skapandet av flera grupper och paneler av gendopningsexperter), och 2016 genomfördes ett rutintest för EPO-gendopning i det WADA-ackrediterade laboratoriet i Australien, Australian Sports Drug Testing Laboratory.
Testmetoderna för gendopning kan dock vara arbetskrävande och kräver en bred kunskap om en specifik DNA-sekvens för själva testmetoden.
Den metod som ADOPE föreslår fokuserar å andra sidan på riktad sekvensering och kombinerar de fördelaktiga principerna för de andra metoderna på ett potentiellt mer effektivt och målinriktat sätt.
ADOPE-testmetoden
ADOPE-testmetodologin har utvecklats genom tester utförda på nötkreatursblod och den är uppbyggd i två faser: den första är en förscreeningsfas som riktar sig mot ett potentiellt gendopat blod, medan den andra riktar sig mot specifika genetiska sekvenser till verifiera om DNA:t verkligen har gendopats eller inte.
'I för-screeningen, förklarar Jard Mattens, Human Practices Manager för TU Delft-teamet som utvecklade ADOPE, utvecklar vi användningen av så kallade dextrintäckta guldnanopartiklar för att detektera gendopning.
'Principen är baserad på det faktum att guldnanopartiklar inducerar en gradvis kvantifierbar färgförändring av provet när det innehåller "dopande" DNA.'
För att arbeta på och testa ett "gendopat DNA" – men utan att behöva faktiskt gendopa idrottare eller djur – spetsade TU Delft-teamet artificiellt nötkreatursblod med flera komplementära DNA-sekvenser.
Syftet med deras tester var att rikta in sig på och hitta de "gendopade" sekvenser som de lade till i blodet.
'Vi använder blod från nötkreatur som ett bra substitut för människoblod eftersom principen fungerar på samma sätt, förklarar Mattens.
'För vårt test lägger vi till flera DNA-typer till detta nötkreatursblod i olika koncentrationer för att efterlikna koncentrationsutvecklingen över tid enligt vad vi tidigare modellerat för människor.
'Från och med den punkten kommer vår detektionsmetod att vara densamma och det DNA som vi lagt till nötkreatursblodet bör detekteras med vår metod.'
När det potentiella gendopade blodet har identifierats på grund av förändring av dess färg, följer den andra fasen av testet, inriktat på de specifika sekvenser som har lagts till blodet.
'För att verifiera denna första screening, fortsätter Mattens, använder vi ett tekniskt unikt och innovativt CRISPR-Cas – Transposase-fusionsprotein.
'Detta kan ses som en nanomaskin som kan specifikt detektera de specifika skillnaderna som finns i gendopnings-DNA.'
CRISPR, eller CRISPR-Cas9 (eller genredigering), är en annorlunda och mer avancerad teknik som tillåter genetiker som använder två molekyler – ett enzym som kallas Cas9 och en bit RNA – för att producera en förändring (mutation) in i DNA:t.
Denna teknik förbjöds också av WADA från början av 2018 som en mer avancerad gen-dopningsteknik, men i fallet med ADOPE används CRISPR-CAS-tekniken för att hitta det modifierade DNA:t istället för att modifiera det.
Särskildheten hos ADOPE
Testmodellen som utvecklats av ADOPE har utformats och utvecklats specifikt för att detektera genen som möjliggör produktion av EPO i människokroppen, men eftersom metoden är mycket mångsidig hävdar forskarna vid TU Delft att den kan vara utvidgas till att upptäcka någon form av gendopning.'
Baserat på cykeln under vilken EPO är effektivt i kroppen, skulle den mest sannolika tiden då idrottare skulle dopa sig med den här specifika genen vara långt före tävlingen – men samtidigt andra gener, inriktade på olika proteiner och fysiologiska förbättringar, kan ha en mycket snabbare effekt.
Det är därför ADOPE siktar på att genomföra de regelbundna antidopingtesterna genom hela tränings- och tävlingskalendern.
Men eftersom det så kallade "cellfria DNA" som testerna riktar sig till förväntas ha mycket låg urinh alt (även om det finns här också), fungerar ADOPE för närvarande bara på blodprover och dess detektering fönstret är fortfarande begränsat.
'Baserat på ett experimentellt test med icke-mänskliga primater av Ni et al 2011,' säger Mattens, 'förväntar vi oss att detektionsfönstret kommer att vara bara några veckor.
'Vidareutveckling av metoden kan göra att samma metod fungerar även för urin i framtiden.'
Skillnaden mellan ADOPE och andra metoder
'De flesta [av de andra gendopningstester] tillvägagångssätten är beroende av PCR-baserade reaktioner [Polymerase-kedjereaktion: en teknik som gör kopior av en specifik DNA-region in vitro], som har många nackdelar, ' tillägg Mattens.
'Dessa reaktioner är relativt arbetskrävande och kräver omfattande förkunskaper om DNA-sekvensen. Dessutom, genom att använda dessa antidopningstesttekniker, vilket gör sannolikheten för att undvika upptäckt betydligt högre.'
Alternativt fokuserar vissa andra testmetoder på hela genomsekvensen; det vill säga hela det genetiska materialet som finns i en cell eller organism.
Men nackdelen med detta tillvägagångssätt är att hela genomsekvensen måste beaktas, vilket är tidskrävande, ineffektivt och kan också ses som ett intrång i idrottares integritet.
'Vårt tillvägagångssätt, säger Mattens, 'fokuserar på riktad sekvensering, som kombinerar fördelaktiga principer från båda tillvägagångssätten på ett komplementärt sätt.
'Den använder specificitetsprincipen för PCR, men den kräver bara ett målställe på transgenen (men kräver flera platser för sökning), vilket gör sannolikheten för att undvika upptäckt betydligt lägre.
'[ADOPE] använder sekvenseringsprincipen för helgenomsekvensering, dock på ett mer effektivt och målinriktat sätt, vilket dramatiskt minskar mängden data.
'Som ett resultat tror vi att riktad sekvensering är ett mycket bättre tillvägagångssätt och framtiden för gendopningsdetektering.'
